分光光度定義

分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。常用的波長范圍為：(1)200～400nm的紫外光區(qū)(2)400～760nm的可見光區(qū),(3)2.5～25μm(按波數(shù)計為4000cm～400cm)的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準(zhǔn)確度，所有儀器應(yīng)按照*計量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進(jìn)行校正檢定。

原理

分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比，其關(guān)系如下式：

A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc

式中 :A 為吸光度;

基本原理

I。為入射的單色光強度;

I 為透射的單色光強度;

T 為物質(zhì)的透射率;

k 為摩爾吸收系數(shù);

L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長

c 為物質(zhì)的濃度

物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r操作。

分光光度計組成

分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。

光譜范圍

包括波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200～400 nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.

鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙,黃綠,藍(lán)靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源.

氫燈(或氘燈)的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400 nm波長的光譜可作為紫外光光度計的光源.

物質(zhì)的吸收光譜(1)

如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線,即光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.

不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì).

物質(zhì)的吸收光譜(2)

當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時透過的光的強度減弱.因為有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收只有一部分光可透過溶液.

入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過光

如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失則:

入射光 = 吸收光 十 透過光

分光光度計特點

1、采用高性能*光柵，波長精度更高;

2、采用進(jìn)口鎢燈，發(fā)光效率高，使用壽命長，功耗降低;

3、超大規(guī)模集成，T/A轉(zhuǎn)換精度高，穩(wěn)定性高;

4、微機系統(tǒng)的應(yīng)用，使操作使用簡單可靠。

分光光度計技術(shù)參數(shù)

波長范圍：320∽1000nm

光譜帶寬：4nm

雜散光：≤0.5%(在360nm處)

波長準(zhǔn)確度：優(yōu)于±2nm

透射比準(zhǔn)確度：≤±1nmT

分光光度計操作方法

1.接通電源，打開儀器開關(guān)，掀開樣品室暗箱蓋，預(yù)熱10分鐘。

2.將靈敏度開關(guān)調(diào)至“1”檔(若零點調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時，需選用較*。)

3.根據(jù)所需波長轉(zhuǎn)動波長選擇鈕。

4.將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對準(zhǔn)光路。

5.在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤指針指向t=0處。

6.蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)“100”調(diào)節(jié)器，使空白管的t=100，指針穩(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測定管的光密度值，并記錄。

7.比色完畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。

注意事項

1.該儀器應(yīng)放在干燥的房間內(nèi)，使用時放置在堅固平穩(wěn)的工作臺上，室內(nèi)照明不宜太強。熱天時不能用電扇直接向儀器吹風(fēng)，防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩(wěn)定。

2.使用本儀器前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理，以及各個操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應(yīng)該對儀器的安全性能進(jìn)行檢查，電源接線應(yīng)牢固，通電也要良好，各個調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確，然后再按通電源開關(guān)。

3.在儀器尚未接通電源時，電表指針必須于“0”刻線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)行調(diào)節(jié)。

分光光度計日常維護(hù)

分析儀器工作者要懂得儀器的日常維護(hù)和對主要技術(shù)指標(biāo)的簡易測試方法，自己經(jīng)常對儀器進(jìn)行維護(hù)和測試，以保證儀器工作在*佳狀態(tài)。

一、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。他們可以引起機械部件的銹蝕，使金屬鏡面的光潔度下降，引起儀器機械部分的誤差或性能下降;造成光學(xué)部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕，產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等，甚至儀器停止工作，從而影響儀器壽命。維護(hù)保養(yǎng)時應(yīng)定期加以校正。應(yīng)具備四季恒濕的儀器室，配置恒溫設(shè)備，特別是地處南方地區(qū)的實驗室。

二、環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體亦可以影響機械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電偶合器的可靠性，也是造成必須學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一。因此必須定期清潔，保障環(huán)境和儀器室內(nèi)衛(wèi)生條件，防塵。

三、儀器使用一定周期后，內(nèi)部會積累一定量的塵埃，*好由維修工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進(jìn)行除塵工作，同時將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固，對光學(xué)盒的密封窗口進(jìn)行清潔，必要時對光路進(jìn)行校準(zhǔn)，對機械部分進(jìn)行清潔和必要的潤滑，*后，恢復(fù)原狀，再進(jìn)行一些必要的檢測、調(diào)校與記錄。